【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對小反芻獸疫病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含小反芻獸疫病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | PPRV RT-PCR反應(yīng)液 | 437.5 μL×1管 | 875 μL×1管 |
2 | PPRV 混合酶液 | 62.5 μL×1管 | 125 μL×1管 |
3 | PPRV 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | PPRV 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA，陽性對照為失去活性的小反芻獸疫病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 適用標(biāo)本類型：發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。
2. 標(biāo)本采集，方法如下：
(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中，密閉送檢。
(2) 腸內(nèi)容物：無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中，立即送檢。
(3) 組織臟器：取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中，密閉送檢。
3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
4.標(biāo)本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表 | RT-PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
混合酶液 | 2.5 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集小反芻獸疫病毒熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 50℃：10分鐘（min） | 1 |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 |
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
FAM |
陽性（＋） | 標(biāo)本中檢出小反芻獸疫病毒RNA |
陰性（－） | 標(biāo)本中未檢出小反芻獸疫病毒RNA |
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更新時(shí)間：2023-05-16 
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